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武漢貝科新肽科技有限公司
主營：原位雜交,亞細(xì)胞定位,蛋白互作,啟動(dòng)子篩選
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基因法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞：
分別用70%乙醇和滅菌蒸餾水清洗金粉（直徑為1 μm），加入滅菌蒸餾水制成金粉懸浮液，取100 μL 放在含有1.0 cm2 洋蔥表皮的玻璃皿中，邊振蕩邊加入10 μL pCambia2301-GaMYB2-GFP質(zhì)粒，蛋白互作，逐步加入40 μL 0.1 mol·L-1 亞精胺和100 μL2.5 mol·L-1 CaCl2，振蕩混勻。基因GDS-80轟擊時(shí)氦氣罐的氣壓為1 300 psi，取10 μL DNA 包裹好的微粒懸浮液加到基因中央，進(jìn)行轟擊，之后放置25℃避光過夜培養(yǎng)，使用ConfocalLaser激光共聚焦顯微鏡觀察。
亞細(xì)胞定位操作步驟
1、通過一些在線網(wǎng)站預(yù)測亞細(xì)胞定位
2、亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建
（1）引物設(shè)計(jì)：利用引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)pEGP-MCS-N1或pEGP-C1-MCS的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)目的基因引物。
（2）載體構(gòu)建：將PCR產(chǎn)物酶切后插入pEGP-MCS-N1或pEF-C1-MCS，得到表達(dá)目的基因與EGP融合蛋白質(zhì)的真核表達(dá)載體。
3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
當(dāng)細(xì)胞生長到對數(shù)生長期時(shí)，接種到共聚焦顯微鏡的玻璃底培養(yǎng)皿（35mm petri dish，10 mm Microwell）中，培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到30%~50%時(shí)，將融合綠色熒光蛋白GFP的重組載體質(zhì)粒和目標(biāo)細(xì)胞器質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。37℃孵箱培養(yǎng)24~72h。
4、激光掃描共聚焦顯微鏡觀察
將上述細(xì)胞分別在24、36、48、72h的時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇對應(yīng)激發(fā)波長（常用405nm、488nm和561nm），使用共聚焦顯微鏡觀察，采取圖像。
1. 葉綠體
葉綠體是植物細(xì)胞中重要的細(xì)胞器之一，它們負(fù)責(zé)進(jìn)行光合作用，將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。為了定位葉綠體，我們可以使用一種名為熒光素的化合物來標(biāo)記它們。熒光素可以被葉綠體中的葉綠素吸收，從而發(fā)出綠色熒光。在洋蔥細(xì)胞中，葉綠體通常位于細(xì)胞的邊緣或周圍。
2. 線粒體
線粒體是細(xì)胞中的另一個(gè)重要細(xì)胞器，它們負(fù)責(zé)產(chǎn)生細(xì)胞所需的能量。為了定位線粒體，我們可以使用一種名為MitoTracker的化合物來標(biāo)記它們。MitoTracker可以穿過細(xì)胞膜并進(jìn)入線粒體，從而發(fā)出紅色熒光。在洋蔥細(xì)胞中，線粒體通常位于細(xì)胞的中央或周圍。
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第3年
